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细胞冻存及复苏基本知识普及:

细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存,可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来,这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞,可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种,起到了细胞保种的作用。

除此之外,还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。细胞冻存时向培养基中加入保护剂--终浓度5%.15%的甘油或二甲基亚砜(DMSO),可使溶液冰点降低,加之在缓慢冻结条件下,细胞内水分透出,减少了冰晶形成,从而避免细胞损伤。 

采用""慢冻快融""的方法能较好地保证细胞存活。标准冷冻速度开始为-1 到 -2℃/min,当温度低于-25℃时可加速,到-80℃之后可直接投入液氮内(-196℃)。

细胞冻存的步骤

(1)选择处于对数生长期的细胞,在冻存前一天换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉,用0.25% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶,加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞,使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min,10分钟)。

(2)去上清液,加入含20%小牛血清的完全培养基,于4℃预冷15分钟后,逐滴加入已无菌的DMSO或甘油,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,细胞浓度为5106~1107/mL之间。(冻存培养液的配置是不是一定要用小牛血清呢答案是不一定的,具体要看培养的细胞类型来选择。

(3)将分装上述细胞悬液于2ml冻存管中,每管0.25ml。冻存管要将盖子盖紧,并标记好细胞名称和冻存日期,同时作好登记(日期、细胞种类及代次、冻存支数)

(4)将装好细胞的冻存管放到冻存盒中,-80℃冰箱过夜。;如果有程序降温器(放在-80℃冰箱过夜,放入液氮罐);或者可以在4℃,2h;然后转到-20℃,2h;-80℃,2h;放入液氮罐。

(5)细胞冻存在液氮中可以长期保存,但为妥善起见,冻存半年后,取出一只冻存管细胞复苏培养,观察生长情况,然后再继续冻存。

如何进行细胞复苏:

1. 从液氮容器中取出冻存管,直接浸入37℃温水中,并不时摇动令其尽快融化。

2. 从37℃水浴中取出冻存管,打开盖子,用吸管吸出细胞悬液,加到离心管并滴加10倍以上培养液,混匀;

3. 离心, 1000rpm,5min;

4. 弃去上清液,加入含10%小牛血清培养液重悬细胞,计数,调整细胞密度,接种培养瓶,37℃培养箱静置培养;

5. 次日更换一次培养液,继续培养。

温馨提醒

1.从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存,但为对数生长期细胞。在冻存前一天换一次培养液;

2.将冻存管放入液氮容器或从中取出时,要做好防护工作(戴棉手套),以免冻伤;

3.冻存和复苏用新配制的培养液。

细胞复苏的时候,有些初次实验员将冻存管从液氮中取出后,放在室温下,经常发生冻存管爆炸,该怎么避免出现这种情况吗其中在拧紧冻存管的时候是否有哪些细节要注意的

一般常用的方法是取出冻存管后在超净工作台中用酒精棉球擦试管口,再稍拧松盖子,再放37度水浴锅中摇溶,在将细胞转移到装有37度预热过的培养基的试管中,迅速离心,再用培养基洗一遍。" RPMI 7666细胞株哪家有 "

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